Laboratoire de Biochimie - UMR 7654

Marc Graille développe une thématique centrée sur la compréhension du mécanisme de terminaison de la traduction chez les organismes eucaryotes et de son couplage avec les mécanismes de dégradation des ARN. Pour cela, il utilise diverses approches expérimentales : génétique chez la levure, biologie moléculaire, biochimie, biophysique et biologie structurale.

1) La terminaison de la traduction et sa régulation.

La terminaison de la traduction a lieu lorsqu’un codon stop de l’ARNm entre dans le site A du ribosome. Il est alors reconnu par un facteur de terminaison de classe I, les protéines RF1/RF2 chez les bactéries et la protéine eRF1 chez les eucaryotes (Fig.1). Suite à cette reconnaissance, ils catalysent l’hydrolyse de la liaison entre la protéine synthétisée et l’ARNt présent au niveau du centre peptidyltransferase du ribosome par l’intermédiaire d’un motif Gly-Gly-Gln (ou GGQ) universellement conservé. Chez les eucaryotes, la protéine eRF1 est assistée dans sa fonction par le facteur de terminaison de classe II : la GTPase eRF3. La spécificité de reconnaissance et la fidélité sont deux aspects très importants dans ce processus de terminaison de la traduction. En effet, les trois codons stop (UAA, UAG et UGA) sont reconnus par le facteur de terminaison de classe I mais des ARNt reconnaissant des codons proches (tel que l’ARNtTrp qui s’apparie avec le codon UGG) sont présents à des concentrations non négligeables dans les cellules. Il est donc important pour éviter les événements de translecture des codons stop qui produiraient des protéines possédant des extensions C-terminales, que les cellules possèdent des mécanismes permettant une reconnaissance optimale des codons stop par les facteurs de terminaison de classe I. C’est à cette notion de fidélité de la traduction que nous nous intéressons plus particulièrement.

a) Méthylation du motif GGQ des facteurs de terminaison de classe I.

La chaîne latérale de la glutamine du motif GGQ des facteurs de terminaison de la traduction de classe I subit une modification post-traductionnelle (N5-méthylation) dans tous les règnes du vivant (Graille et al ; Biochimie ; 2012). Nous étudions le mécanisme de méthylation et le rôle de cette modification en collaboration avec l’équipe de Valérie Heurgué-Hamard (IBPC, Paris, France). Chez les bactéries, cette réaction est catalysée par le protéine PrmC et nous avons précédemment déterminé les bases moléculaires responsables de la méthylation de RF1 par PrmC (Fig.2A ; Graille et al ; Mol. Cell ; 2005). Cette étude a révélé que la protéine RF1 et vraisemblablement son homologue RF2, subissent des changements de conformation importants et nécessaires à leur bon fonctionnement dans leur activité de terminaison de la traduction. Plus récemment, nous avons montré que chez les organismes eucaryotes, le motif GGQ d’eRF1 est méthylé par le complexe Mtq2-Trm112 où Mtq2 est la sous-unité catalytique et Trm112 joue un rôle d’activateur de Mtq2 (Heurgué-Hamard et al ; J. Biol. Chem. ; 2006). Le rôle de la méthylation d’eRF1 sur l’efficacité de terminaison de la traduction reste méconnu. Nous avons résolu la structure de la protéine Trm112 de levure révélant une organisation en deux domaines dont un fixe un atome de zinc (Fig.2B). Nous avons récemment déterminé la structure 3D du complexe entre Mtq2 et Trm112, ce qui a permis de mettre en évidence le mode d’activation de Mtq2 par Trm112 (Fig.2C ; Liger et al ; Nucleic Acids Res. ; 2011). Trm112 interagit avec et active également trois autres protéines à activité methyltransférase (Bud23, Trm9 et Trm11 ; Fig.2D) qui modifient des ARN de transfert (Trm9 et Trm11) ou sont impliquées dans la synthèse de la sous-unité 40S du ribosome (Figaro et al ; Mol. Cell. Biol. ; 2012).

b) Tpa1 et Ett1 : des régulateurs de l’efficacité de la terminaison de la traduction en réponse à la disponibilité en O2 ?

La protéine Tpa1 a été récemment caractérisée chez la levure S. cerevisiae où elle fait partie d’un complexe multi-protéique (incluant également eRF1, eRF3 et Pab1) fixé à l’extrémité 3’ des ARNm. La délétion du gène codant pour la protéine Tpa1 affecte l’efficacité de terminaison de la traduction. Nous avons résolu la structure cristallographique de la protéine Tpa1 de S. cerevisiae (Fig.3A), révélant une organisation en deux domaines dont un possède une forte similarité structurale avec des prolyl-4-hydroxylases, (enzymes qui catalysent l’hydroxylation des chaînes latérales des prolines des protéines en présence d’O2). En collaboration avec l’équipe du Dr Bertrand Séraphin (IGBMC, Illkirch, France), nous avons montré que les deux domaines de la protéine Tpa1 ainsi que l’intégrité de son site actif putatif sont nécessaires pour que l’efficacité de terminaison de la traduction soit optimale (Fig.3B ; Henri et al ; J. Biol. Chem. ; 2010). Nous avons aussi montré que Tpa1 inhibe l’activité du facteur de transcription Hap1 qui est impliqué dans la réponse à l’hypoxie. Enfin, nous avons identifié un nouvel acteur de la terminaison de la traduction qui interviendrait dans la même voie que Tpa1 : la protéine Ett1 (pour Enhancer of translation termination 1 ; Fig.3B) Nous avons récemment résolu la structure tridimensionnelle d’Ett1 et identifié une région conservée et fonctionnellement très importante (Fig.3C ; Rispal et al ; RNA ; 2011)

2) Mécanismes de contrôle-qualité des ARN dépendants de la traduction.

Lors de la transcription de l’ADN en ARN et de la maturation des ARNm, l’introduction d’erreurs peut grandement influencer l’expression de certains gènes et/ou l’activité des protéines pour lesquels ils codent. Pour minimiser ces défauts de maturation, les cellules eucaryotes ont développé plusieurs mécanismes de contrôle-qualité qui détectent et dégradent ces ARNm aberrants. Les mécanismes précis de ces voies restent peu connus et sujets à controverse mais tous reposent sur l’implication des facteurs de terminaison de la traduction (eRF1 et eRF3) ou de protéines structuralement proches (Dom34 et Hbs1) pour détecter les ARNm aberrants.

a) Contrôle de la qualité des ARNm par la voie NMD : différences mécanistiques entre terminaison de la traduction prématurée et normale.

Lors de la transcription de l’ADN en ARN et de la maturation des ARNm, des mutations génétiques, des erreurs de transcription ou d’épissage peuvent introduire des codons stop précoces au niveau de l’ARNm (5-10% des ARNm eucaryotes seraient concernés). Il est estimé qu’un tiers des maladies génétiques, telles que la dystrophie musculaire de Duchenne ou la mucoviscidose, ainsi que divers cancers seraient dus à des évènements conduisant à une terminaison prématurée de la traduction. Cependant, des protéines tronquées sont rarement détectées en raison de l’existence d’un mécanisme de contrôle couplé à l’étape de la traduction : la voie de dégradation des ARNm aberrants (ou NMD pour non-sense mediated mRNA decay). La voie NMD détecte la grande majorité de ces ARNm défectueux et les élimine rapidement du pool d’ARNm à traduire. Elle fait notamment intervenir les facteurs de terminaison de la traduction eRF1 et eRF3 mentionnés ci-dessus, les trois facteurs Upf spécifiques de cette voie et les protéines impliquées dans la dégradation normale des ARNm. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes permettant de discriminer entre les codons stop normaux et aberrants et d’induire la dégradation spécifique des ARNm possédant ces codons stop précoces. Ce projet soutenu par un financement HFSP, est réalisé en collaboration avec les équipes de S. Kervestin et V. Heurgué-Hamard (IBPC, Paris, France), d’A. Jacobson (Massachussets University, USA) et de M. Ehrenberg (Uppsala University, Suède).

b) Mécanismes de contrôle qualité des ARN induisant des pauses lors de la traduction : voies NGD et NRD.

D’autres mécanismes de surveillance éliminant les ARNm qui empêchent les ribosomes de réaliser l’élongation de la traduction, ont été mis en évidence récemment. Il s’agit des voies NGD (pour No-Go Decay), 18S-NRD (pour 18S Nonfunctional rRNA decay) et NSD (pour Non-Stop Decay). Ces voies nécessitent les protéines Dom34 et Hbs1, qui sont similaires à eRF1 et eRF3, respectivement. L’objectif de ce projet est de comprendre le mode d’action de ces deux protéines dans ces mécanismes de surveillance. Les structures des protéines Dom34 (Graille et al ; J. Biol. Chem. ; 2008) et Hbs1 ainsi qu’un modèle à basse résolution du complexe Hbs1-Dom34 ont été obtenues (Fig.4 ; van den Elzen ; Nat. Struct. Mol. Biol. ; 2010). Des expériences de génétique réalisées par l’équipe de notre collaborateur Bertrand Séraphin (IGBMC, Illkirch, France), ont montré que la fixation de nucléotide par Hbs1 est cruciale pour la NGD et la NRD tandis que l’interaction entre Dom34 et Hbs1 est nécessaire pour la NGD mais pas pour la NRD.

Publications relatives à cette thématique.

* Figaro S, Wacheul L, Schillewaert S, Graille M, Huvelle E, Mongeard R, Zorbas C, Lafontaine DLJ, Heurgué-Hamard. (2012) Trm112 is required for Bud23-mediated methylation of the 18S rRNA at position G1575. Mol. Cell. Biol. In press

* Graille M, Figaro S, Kervestin, S, Buckingham RH, Liger D, Heurgué-Hamard V. (2012) Methylation of class I translation termination factors : structural and functional aspects. Biochimie. In press (Review)

* Rispal D, Henri J, van Tilbeurgh H, Graille M, Séraphin B. (2011) Structural and functional analysis of Nro1/Ett1 : a protein involved in translation termination in S. cerevisiae and in O2-mediated gene control in S. pombe. RNA. 17(7), 1213-24.

* Liger D, Mora L, Lazar N, Figaro S, Henri J, Scrima N, Buckingham RH, van Tilbeurgh H, Heurgué-Hamard V, Graille M. (2011) Mechanism of activation of methyltransferases involved in translation by the Trm112 « hub » protein. Nucleic Acids Res. 39(14), 6249-59.

* van den Elzen AMG, Henri J, Lazar N, Gas-Lopez M, Durand D, Lacroute F, NicaiseM, van Tilbeurgh H, Séraphin B, Graille M. (2010) « Dissection of Dom34-Hbs1 reveals independent functions in two RNA quality control pathways. » Nat. Struct. Mol. Biol. 17(12), 1446-53.

* Henri J, Rispal D, Bayart E, van Tilbeurgh H, Séraphin B, Graille M. (2010) « Structural and functional insights into S. cerevisiae Tpa1, a putative prolyl hydroxylase influencing translation termination and transcription. » J Biol Chem, 285(40), 30767-78.

* Graille M, Chaillet M, van Tilbeurgh H. (2008) « Structure of yeast Dom34 : a protein related to translation termination factor eRF1 and involved in No-Go decay. » J Biol Chem. 283(11), 7145-54.

* Heurgué-Hamard V, Graille M, Scrima N, Ulryck N, Champ S, van Tilbeurgh H, Buckingham RH. (2006) « The zinc finger protein Ynr046w is plurifunctional and a component of the eRF1 methyltransferase in yeast. » J Biol Chem. 281(47), 36140-8.

* Graille M, Heurgue-Hamard V, Champ S, Mora L, Scrima N, Ulryck N, van Tilbeurgh H, Buckingham RH. (2005) « Molecular Basis for Bacterial Class I Release Factor Methylation by PrmC. » Mol. Cell. 20(6), 917-27.